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TEM生物样品 离体细胞的取材固定及注意事项

更新时间:2021-12-12 点击数:9924

离体细胞包括培养细胞、脱落细胞、细菌、精子、卵子和血液细胞等,多分散在不同介质中。取材的关键是使细胞完好无损地从介质中分离出来,富集形成细胞团块(如富集细胞团块较大,须分割成约3mm3的小块)。

离体细胞取材与固定方法主要有:离心沉淀法和原位固定法等,视不同研究目的而定。取材前,应根据不同种类培养细胞及其研究目的,选择合适的取材时间点,确保细胞存活状态符合研究目的,细胞数量≥106,同时应调整缓冲液与2~4%醛类固定液pH及细胞培养液pH相同,温度接近。刚从4℃冰箱取出的缓冲液和固定液不能直接注入培养细胞。

A.悬浮培养细胞取材与固定

1)将全细胞悬液置入洁净离心管;

2800-1 000 r/min低速离心5 min,使离心管底部形成细胞团;

3弃去上清液,加入缓冲液,选择合适的离心速率和时间,如采用5 000 r/min,离心5-10 min,至出现致密贴壁的细胞团块、用牙签挑起而不散;

4)弃去上清液,注入2%4%戊二醛(或多聚甲醛和戊二 醛混合固定液),即送专业实验室进入后续制备。

注意:当用牙签挑起细胞团块时,若细胞呈分散状,即在离心管中注入5µL左右血清或蛋清,充分混合后再次离心,至管底部出现致密细胞团块。为提高细胞固定效果,也可以先在细胞培养液中加入等量醛类固定液,固定5 min之后再离心,但细胞不易成团,需滴加5µL左右血清或蛋清混匀后离心。

B.贴壁培养细胞的取材与固定

依据研究目的和要求不同,贴壁培养细取材有3种方法。一是先离心后固定,即:弃去培养液,加入等温的缓冲液,用细胞划片刮取细胞形成细胞悬液,参照上述悬浮细胞取材步骤操作。二是先固定、后离心,即:弃去一半或分部培养液,快速加入适量等温醛类固定液,固定5min左右,刮起细胞为细胞悬液。三是原位固定、倒扣包埋。(详见微亚技术文件)

注意:每种细胞(包括细菌)大小不同,其最佳离心富集速率和时间不同,参考值为:5000r/min5~10min。太高离心转速和离心时间会造成细胞挤压、变形等;而太低转速往往不能一次离心成团,反复离心同样损伤细胞。应充分检索文献并确认取材细胞适宜的富集速率、时间再着手实验。

C.极少的离体细胞取材与固定

对于极少的离体细胞(<104),如脱落细胞等,收集细胞有一定难度,可采用尖底离心管或自制模具,注入血清或抗凝血浆,与细胞充分混合后离心。

D.卵母细胞和受精卵细胞的取材与固定

虽然卵母细胞和受精卵细胞体积很大,但每枚卵细胞在缓冲液中都是透明的,并且数量少,肉眼难以观察。为形成可视的细胞团块,取材时可选择其他培养细胞,如颗粒细胞等与卵细胞混合离心,将卵细胞包被在适量的非卵细胞之中,再按上述方法处理。

E.血细胞的取材与固定

首先要解决血液凝固问题,加入肝素、柠檬酸钠或EDTA等抗凝剂,阻止血小板与纤维蛋白结合,例如采用3.8%柠檬酸钠,当抗凝剂与血液的比例为1 9时,血液不会凝固。然后,将抗凝全血以1000r/min15 min离心,离心管抗凝血液便析出三层细胞,底部是红色的红细胞,中间层是白色的白细胞和血小板,最上层透明的是血浆,用毛细吸管缓慢吸取上清液,再用毛细吸管缓慢吸取所需要的细胞,按上述方法离心沉淀法形成紧密细胞团块。

(外地课题组寄送样品,请注意参考:5.寄送电镜样品注意事项)

 



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